¿Cómo se determina la secuencia de procesos?

Secuenciación Sanger youtube

El Proyecto Genoma Humano fue un proyecto de 13 años de duración, financiado con fondos públicos, que se inició en 1990 con el objetivo de determinar la secuencia de ADN de todo el genoma humano eucromático en un plazo de 15 años. En sus inicios, el Proyecto Genoma Humano fue recibido con escepticismo por muchas personas, tanto científicos como no científicos. Una de las cuestiones más importantes era si el enorme coste del proyecto superaría los beneficios potenciales. Hoy, sin embargo, el éxito abrumador del Proyecto del Genoma Humano es evidente. La finalización de este proyecto no sólo marcó el comienzo de una nueva era en la medicina, sino que también dio lugar a importantes avances en los tipos de tecnología utilizados para secuenciar el ADN.

A continuación, los clones individuales de BAC seleccionados para el análisis de la secuencia del ADN se fragmentaron aún más, y los fragmentos de ADN genómico más pequeños se subclonaron en vectores para generar una biblioteca shotgun derivada de BAC. Los insertos se secuenciaron utilizando cebadores que coincidían con la secuencia del vector que flanqueaba el inserto de ADN genómico, y los clones shotgun superpuestos se utilizaron para generar una secuencia de ADN que abarcaba todo el clon BAC. En la Figura 3 se muestra un resumen de este paso.

Pasos de la secuenciación Sanger

Los betacoronavirus son un grupo de virus de ARN monocatenario de sentido positivo con envoltura que pertenecen a la subfamilia Coronavirinae de la familia Coronaviridae. Los genomas de estos virus, cuyo tamaño oscila entre 27 y 32 kb, son los más grandes entre los virus de ARN. Cada genoma codifica poliproteínas que se someten a proteólisis para convertirse en proteínas no estructurales de diversas funciones, como las proteasas virales (3CL, PL) y la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), todas ellas integrales para la transcripción y la replicación. Estos genomas también codifican varias proteínas estructurales, como la proteína de espiga (S), la proteína de membrana (M), la pequeña proteína de membrana de la envoltura (E) y la proteína de la nucleocápside (N). Este artículo seminal, publicado en Cell a principios de 2020, revisa la arquitectura del transcriptoma del SARS-CoV-2 y el mecanismo de expresión génica viral.

Una de las características más notables de los coronavirus es su mecanismo intrínseco de corrección de pruebas. El proceso de replicación de los virus de ARN suele presentar altas tasas de error y da lugar a cuasiespecies, es decir, a una población de virus con diferentes mutaciones genómicas adquiridas a través de errores de replicación que residen todos en el mismo huésped. Sin embargo, los coronavirus codifican una proteína llamada proteína no estructural 14 (nsp14) que posee actividad de corrección de pruebas. Se cree que este mecanismo de corrección de pruebas es importante para los coronavirus debido a sus grandes y complejos genomas. Sin él, las elevadas tasas de mutación típicamente asociadas a la replicación de los virus de ARN tendrían un efecto perjudicial sobre la aptitud de los coronavirus. Aunque la tasa de mutación de los coronavirus (incluido el SARS-CoV-2) es aproximadamente 10 veces menor que la de otros virus de ARN, estos virus siguen adquiriendo algunas mutaciones al propagarse de un huésped a otro. Para el SARS-CoV-2, los epidemiólogos estiman una tasa de mutación de 33 mutaciones genómicas/año. Los científicos utilizan la presencia de estas mutaciones en los genomas del SARS-CoV-2 para asignar un linaje o clado a cada cepa. Uno de los esquemas publicados recientemente en Nature Microbiology por científicos del Reino Unido implica la designación de una cepa del virus como 1 de los 2 linajes (A o B), seguido de valores numéricos basados en la evidencia filogenética de la emergencia de un linaje ancestral en otra población geográficamente diferenciada.

Secuenciación de Illumina

La determinación del orden de los bloques de construcción del ADN (nucleótidos) en el código genético de un individuo, denominada secuenciación del ADN, ha hecho avanzar el estudio de la genética y es una de las técnicas utilizadas para detectar trastornos genéticos. Dos métodos, la secuenciación del exoma completo y la secuenciación del genoma completo, se utilizan cada vez más en la asistencia sanitaria y la investigación para identificar variaciones genéticas; ambos métodos se basan en nuevas tecnologías que permiten la secuenciación rápida de grandes cantidades de ADN. Estos métodos se conocen como secuenciación de nueva generación (o secuenciación de nueva generación).

La tecnología de secuenciación original, denominada secuenciación Sanger (llamada así por el científico que la desarrolló, Frederick Sanger), fue un avance que ayudó a los científicos a determinar el código genético humano, pero es larga y costosa. El método Sanger se ha automatizado para hacerlo más rápido y aún se utiliza en los laboratorios para secuenciar trozos cortos de ADN, pero se necesitarían años para secuenciar todo el ADN de una persona (conocido como genoma de la persona). La secuenciación de nueva generación ha acelerado el proceso (sólo se tarda entre días y semanas en secuenciar un genoma humano) y ha reducido el coste.

Secuenciación de nueva generación

Secuenciar el ADN significa determinar el orden de los cuatro componentes químicos -llamados “bases”- que componen la molécula de ADN. La secuencia indica a los científicos el tipo de información genética que contiene un determinado segmento de ADN. Por ejemplo, los científicos pueden utilizar la información de la secuencia para determinar qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos llevan instrucciones reguladoras, activando o desactivando genes. Además, y esto es muy importante, los datos de la secuencia pueden poner de manifiesto los cambios en un gen que pueden causar una enfermedad.

Una nueva tecnología de secuenciación consiste en observar las moléculas de la ADN polimerasa mientras copian el ADN -las mismas moléculas que hacen nuevas copias del ADN en nuestras células- con una cámara de cine muy rápida y un microscopio, e incorporando diferentes colores de tintes brillantes, uno para cada letra A, T, C y G. Este método proporciona una información diferente y muy valiosa que la que proporcionan los sistemas de instrumentos de uso más común.

Otra nueva tecnología en desarrollo consiste en el uso de nanoporos para secuenciar el ADN. La secuenciación de ADN basada en nanoporos consiste en hacer pasar cadenas de ADN individuales a través de poros extremadamente pequeños en una membrana. Las bases de ADN se leen de una en una a medida que pasan por el nanoporo. Las bases se identifican midiendo las diferencias en su efecto sobre los iones y la corriente eléctrica que fluye a través del poro. El objetivo es que la secuenciación cueste menos y se haga más rápido. A diferencia de los métodos de secuenciación que se utilizan actualmente, la secuenciación del ADN por nanoporos permite a los investigadores estudiar la misma molécula una y otra vez.